作者：石油醚

引言

近日， Merck & Co., Inc.结合多种过程分析技术（PAT），成功开发了一条由内消旋双环胺1经生物催化氧化直接生成亚硫酸氢盐加合物3的工艺，进而规避纯氧依赖。

Biocatalytic Oxidative Desymmetrization of the Substituted Pyrrolidine Intermediate of MK-7845: An Investigational Antiviral Therapy for COVID-19

Shorouk O. Badir,* Yangzhong Qin,* Michelle Zheng, David A. Vargas, Birgit Kosjek, Ajit Vikram, Anna L. Dunn, Michael Whittington, Yining Ji, Keith A. Mattern, Alex M. Confer, Jonathan M. E. Hughes, Reed T. Larson, Justin A. Newman, Nastaran Salehi Marzijarani, Nadine Kuhl, and Jamie M. McCabe Dunn

Org. Process Res. Dev. 2026. DOI : 10.1021/acs.oprd.5c00394

正文

冠状病毒病（COVID-19）由SARS-CoV-2引起的一种高传播性传染病，2020年迅速演变为全球大流行，致死超700万人。2020年底，多方协作（包括企业、政府与学术机构）成功研发出突破性疫苗，成为抗疫关键里程碑。然而，病毒变异频发、全球疫苗接种不均及保护效力下降，凸显了对安全有效抗病毒药物的迫切需求。代表性进展包括默沙东与Ridgeback联合开发的口服核苷前药molnupiravir（MK-4482），以及辉瑞研发的3CL蛋白酶抑制剂nirmatrelvir（PF-07321332，Paxlovid组分）。为此，科学家进一步开发一种新型可逆共价3CL蛋白酶抑制剂——MK-7845（Figure 1）。

Merck & Co., Inc.近期开发了一条更高效、可持续的MK-7845合成新路线，以支持3CL蛋白酶抑制剂候选物的快速获取。关键步骤是涉及异氰酸酯4、(S)-叔亮氨酸5和手性双环亚胺2三组分的Ugi偶联反应（Scheme 1）。其中，亚胺2需高效制备，并以结晶性三聚体形式分离。文献中虽有通过经典拆分法实现N-chloro-3-azabicyclo[3.3.0]octane脱卤化氢的报道，但采用FAD依赖型胺氧化酶直接催化双环胺1的不对称氧化，一步构建手性亚胺2。该策略更简洁、原子经济性更高，且避免拆分带来的物料与能耗浪费。

前人研究发现，含FAD的单胺氧化酶（如MAO-N D5）可高效催化3,4-取代内消旋吡咯烷的脱对称化反应。该类氧化酶在碱性条件下以O₂为氧化剂，将仲胺直接转化为亚胺，同时生成H₂O₂（Scheme 2）；后者可由共添加的过氧化氢酶原位分解为H₂O和O₂。

Merck & Co., Inc.科学家利用胺氧化酶成功开发了一条可放大的去对称化工艺，用于制备r bicyclic [3.1.0]proline中间体。然而，需在密闭反应器中通入纯氧以保障胺氧化及后续磺化反应效率，进而带来显著的安全风险和放大难度。近日，Merck & Co., Inc.结合多种过程分析技术（PAT），成功开发了一条由内消旋双环胺1经生物催化氧化直接生成亚硫酸氢盐加合物3的工艺，进而规避纯氧依赖。此外，该团队还建立加合物3在碱性条件下转化为手性亚胺2（以结晶性三聚体形式分离）的初步分离方法（Scheme 1）。

首先，Meck团队评估Codexis公司提供的三种MAO酶（MAO-106、MAON401¹⁴和MAO−P1B01）对底物1的氧化活性。鉴于亚胺产物2会不可逆抑制MAO酶，加入NaHSO₃将其原位捕获为水溶性、无酶抑制性的亚硫酸氢盐加合物3。初始实验采用MAO-106（20 wt% 发酵粉）、0.1 wt% 过氧化氢酶及1.5 eq NaHSO₃，在磷酸盐缓冲液中敞口反应（无气流）。结果表明：底物1一次性投料可实现可接受转化率，但需极低浓度（Table 1），导致实用性受限。

为抑制挥发性亚胺2累积并实现其向亚硫酸氢盐加合物3的即时捕获，作者采用MAON401酶，实施胺1与NaHSO₃在24 h内的同步缓慢流加。该策略使用20 wt% MAON401，将目标加合物3收率提升至90 LCAP。同时，反应生成足量亚胺2用于构型确证，UPLC分析显示ee >98%。为进一步降低酶载量，平行筛选MAO−P1-B01（Codexis），其在相同流加模式下活性更优：仅需5–10 wt%酶载量，即可在25 mg/mL（以HCl盐计为40 V）条件下实现克级规模91%转化率。后续缓冲体系筛选证实，磷酸钾缓冲液（KPi）仍为最优选择（Figure 2）。

其次，在MAON401催化的双环胺1（以HCl盐计，16 g）有氧脱对称化制备亚硫酸氢盐加合物3的早期放大实验中，发现质量不平衡（Scheme 3），且缺口波动明显，表明该反应稳健性不足。尤为关键的是，反应器顶部析出固体（Scheme 3），提示挥发性导致物料损失。对该固体进行¹H NMR（CDCl₃）分析，确认其为亚胺2的信号；进一步鉴定证实其为亚胺2的结晶三聚体——说明亚胺单体在反应条件下易挥发（三聚体性质详见后文）。为直接验证单体2的挥发性，分别配制亚胺2和胺1溶液，置于NMR管中氮气吹扫并实时监测：亚胺2由加合物3（D₂O溶液）调pH至13原位生成（Figure 3A），仅氮气吹扫5 min即完全消失；而胺1溶液经氮气吹扫过夜，信号无衰减（Figure 3B）。结果确证：亚胺2具显著挥发性，胺1则基本不挥发。

其次，在封闭加压系统中进行氧化反应，以排除亚胺2发生显著分解是质量平衡缺口的潜在原因（Figure 4）。反应过程中同步监测顶空与溶液中的溶解氧（dO），数据统一以饱和度百分比表示（Figure 4）。在50 wt% MAON401、25%反应器填充体积及50 psig供气压力下，氧气供应充足（Figure 4）。更重要的是，¹H NMR分析证实亚胺2定量生成，直接排除了主产物分解路径。因此，开放体系下的质量不平衡主要源于亚胺2挥发；抑制其挥发是提升收率的关键。

随后，作者通过实时追踪MAO反应中各组分的动态变化，来抑制亚胺2挥发损失。鉴于该反应为液–固–气多相体系，且关键中间体（如亚胺2、HSO₃⁻）无紫外吸收、易氧化或不稳定，常规离线分析受限。因此，整合多种过程分析技术（PAT）：氧传感器、拉曼光谱和流动¹H NMR，系统解析反应路径。FTIR因信号微弱被排除；而拉曼光谱在全反应过程中清晰分辨出胺1、亚胺2、加合物3、HSO₃⁻及SO₄²⁻（有氧氧化副产物）的特征峰（Figure 5A，彩色标注），各物种经独立制备的标准品验证；MAO与过氧化氢酶的参考谱图证实其无光谱干扰。进一步 建立拉曼定量模型：HSO₃⁻与SO₄²⁻采用已知浓度标准品直接校准；胺1、加合物3与亚胺2则通过流动¹H NMR同步监测，以其准确定量结果标定拉曼响应。综合校准后，拉曼光谱可实现对上述五种关键组分的全程定量跟踪（Figure 5B）。尤其重要的是，HSO₃⁻极易被氧气氧化，无法通过离线法准确测定；原位拉曼是本体系中唯一可靠追踪其浓度的手段。

如Figure 5B所示，采用1.5eq.NaHSO₃的反应经拉曼监测可分为四个阶段：（I）0–20 h（粉色）：胺1与NaHSO₃预混后缓慢流加；二者浓度上升，同时加合物3生成——表明未完全反应；（II）20–36 h（绿色）：胺1与NaHSO₃持续消耗，加合物3积累至峰值；36 h时NaHSO₃耗尽，加合物3达最大值，且与Na₂SO₄生成曲线（紫色）高度同步；（III）36–54 h（黄色）：NaHSO₃耗尽后，胺1继续消耗，亚胺2迅速生成并达饱和，加合物3浓度显著下降；（IV）54–84 h（蓝色）：加合物3持续分解，浓度进一步降低。 全程质量平衡（胺1 + 加合物3 + 亚胺2，橙色曲线）在36 h后急剧下降，恰与NaHSO₃耗尽、加合物3减少及亚胺2上升同步。这证实：NaHSO₃耗尽导致加合物3/亚胺2平衡向右移动，释放出挥发性亚胺2；在通气条件下，其迅速蒸发损失。该现象与前期证实的亚胺2挥发性一致（Scheme 3，Figure 3A）。此外，无NaHSO₃时，胺1转化仍生成挥发性亚胺2，进一步扩大质量平衡缺口。加合物3可逆解离导致产物损失的假说，亦获36 h后pH骤降（Figure 5C）支持。溶解氧（dO）监测显示：流加期dO缓降至约70%，NaHSO₃耗尽后迅速回升至100%（Figure 5C），证实反应全程不受氧限制。

鉴于NaHSO₃对稳定加合物3形成的关键作用，假设提高其用量可缩小质量平衡缺口并提升收率；但过量NaHSO₃可能与MAO竞争O₂，抑制主反应。为此，在~16 g（胺HCl计）规模下系统考察了3种NaHSO₃投料策略（Scheme 4），全程拉曼监测（Figure 6）。

• 1.5 equiv分24 h流加：NaHSO₃于~30 h耗尽，终产物加合物3收率79%（Raman）/76%（¹H NMR）；
• 随后补加1.5 equiv（24–48 h）：避免耗尽，收率升至85%/90%；
• 一次性投料3 equiv（0–24 h）：NaHSO₃全程充足，收率达峰值87%/92%，为最优条件；
• 过量投料5 equiv：反应明显变慢，收率反降至81%（Raman），归因于NaHSO₃与O₂副反应生成大量Na₂SO₄。

据此选定3 equiv NaHSO₃为基准条件，并换用高活性变体MAO−P1-B01（5 wt%）与催化剂量过氧化氢酶（0.5 wt%），在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.6）中完成~190 mmol级氧化反应，实现亚胺2结晶三聚体的初步制备。反应结束后，K₃PO₄调pH使加合物3解离释放亚胺2；加入甲苯（10 V）萃取，硅藻土过滤除酶；有机相于0 °C用乙腈（10 V）稀释，接种1 wt%亚胺2三聚体晶种，再于6 h内缓慢滴加乙腈（20 V），析出目标产物——亚胺2结晶三聚体，分离收率50%，ee >99%，纯度99 wt%。其绝对构型由亚胺三聚体–亮氨酸5盐的单晶X射线结构确证。PXRD显示游离碱三聚体以两种无水多晶型存在：晶型 1（P2₁2₁2₁空间群，CSD: GUVJOX）与晶型2（，新发现P2₁空间群，晶胞体积差异<1%）。熔融态样品快速结晶为晶型2，随后数日内室温缓慢转为热力学更稳定的晶型1，解释了开发中两相共存现象。

结论

综上，Merck & Co., Inc.结合多种过程分析技术（PAT），成功开发了一条由内消旋双环胺1经生物催化氧化直接生成亚硫酸氢盐加合物3的工艺，进而规避纯氧依赖。此外，该团队还建立加合物3在碱性条件下转化为手性亚胺2（以结晶性三聚体形式分离）的初步分离方法。通过投加足量NaHSO₃，将挥发性亚胺2原位捕获为水溶性加合物3，有效抑制克级反应中的产物损失，保障高收率与高对映选择性。全程依托PAT工具（氧传感器、原位拉曼、流动¹H NMR）定量解析反应动力学、厘清质量平衡缺口根源，并驱动工艺优化。

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